概述

植入前遗传学诊断(PGD)是治疗与不孕相关的遗传问题的有效方法。此外，下一代测序(NGS)+PGD为非整倍体筛选等诊断和评估提供了新的可能性和新的参数。本研究的目的是报道罗氏易位24条染色体非整倍体筛查PGD后妊娠结果。第3天胚胎染色体非整倍体筛选在连续两个体外受精(IVF)周期中进行，首先是荧光原位杂交(FISH)，然后是基于NGS的方案。在每一次试管婴儿尝试中，都对三个胚胎进行了活组织检查。短时间的程序使新鲜胚胎移植不需要玻璃化。第一个体外受精周期选择胚胎使用PGD分析与鱼的方法结束妊娠损失在第8周。基于ngs的非整倍体筛选的第二次尝试排除了以下两个胚胎:一个具有22个单体的胚胎和一个具有多个非整倍体的胚胎。移植的唯一的整倍胚泡导致成功的妊娠结局。基于NGS应用的整倍体胚胎鉴定是基于ngg的PGD在罗氏易位载体夫妇中首次成功的临床应用。

罗氏易位是人类种群中最常见的平衡结构染色体重排，其发生频率约为千分之一。大多数罗氏易位病例涉及两种不同的核心染色体。异源型罗氏易位携带者在不育夫妇中比在健康人群中诊断出现频率更高(尤其是在少精男性中)。众所周知，罗氏易位携带者存在受孕不平衡的风险，因此男性携带者是胞浆内精子注射(ICSI)和植入前基因诊断(PGD)的候选对象。

以前发表的关于罗氏易位携带者的PGD病例通常涉及用FISH法诊断倍性状态。然而，在这种情况下，关于其他胚胎染色体不平衡的报告表明，有必要扩大分析范围，包括额外的染色体拷贝数异常。自2013年8月以来，下一代测序(NGS)已在各种PGD协议中使用。本报告以罗氏易位载波为例，介绍了基于NGS的PGD应用。

患者和方法

2011年，一对患有5年原发性不孕症的夫妇(女性31岁，男性46岁)正在诊所寻求治疗。2009年男子被诊断为严重少精症，确定为不育主要原因。

这对夫妇进行了标准的临床检查，所有激素结果正常，女性核型正常。男性核型异常，发现罗氏易位45,XY,der (14;15) (q10;q10)。这对夫妇决定接受试管受精后，就PGD的选择和成功率、误诊风险以及可能的遗传、临床和结果进行了遗传咨询。由于父亲为罗氏杂合子的情况下父亲与孩子之间传播的风险较低，因此这对夫妇决定不对14和15号染色体进行PGD诊断。

易位载体状态与子代非整倍体的高风险有关，因此，我们提出14q和15q染色体融合的FISH分析。获得了一份书面同意书，其中说明了可能存在的体外手术和PGD误诊风险。此外，对于PGD后的每一次妊娠检查，都建议进行产前确诊。

体外受精计划，女性每天使用促排卵药物进行刺激，持续9天。我们最终找到了12个卵母细胞。第3天对3个胚胎进行囊胚活检，并从每个胚胎中轻轻地吸入一个囊胚。

活检后，每个胚胎洗净，转入培养皿，再培养2天。探针的特异性和敏感性之前已经通过患者淋巴细胞培养进行了测试。特异性为100%，有效率为84~95%。FISH信号由两名技术人员独立进行评分和解释。培养第5天转入形态为整倍胚泡。妊娠11天后确诊-hcg 指数为94mIU/mL。怀孕在第8周以流产告终。患者没有利用细胞遗传学研究流产原因。

在第二个IVF周期中，患者决定使用新的基于NGS的PGD方法，同时对所有24条染色体进行易位和非整倍体诊断。2013年9月，如前所述进行ICSI程序和PGD准备的胚胎培养。第2个IVF周期获得的3个胚胎在第3天进行了活检。

PGD NGS方法将每条染色体的覆盖率校正，并使用检测样本与72个男性和52个女性的整倍体样本基线值进行非整倍体检测。消除了样本间读取覆盖方差对伪阳性的影响。雄性对照样品与来自囊胚的探针一起处理，并进行相同的计算分析，以排除任何性能故障。对阴性对照样品进行处理，排除污染。该方案通过验证，在检测整个染色体非整倍体方面是非常准确的。

第5天，移植单个健康的整倍体胚泡。第15周确认妊娠并进行产前诊断。

结果

在培养的第3天，从3个胚胎中提取了3个囊胚，并对这两个周期进行了分析。这对夫妇的胚胎学和PGD结果如下表所示。

讨论

最初，引入PGD的主要原因是为了避免单基因疾病导致严重后果而终止妊娠。此后不久，PGD的适应症被扩大到具有高恶性倾向的迟发性疾病，包括染色体畸变。由于胚胎选择方法的改进，筛选与父母年龄有关的非整倍体成为PGD的主要用途之一，同时也是为了避免异常遗传基因的遗传。不仅是为了检测异常分离易位的染色体，而且还为了检测其他染色体的非整倍体的风险。然而，在男性低精子症携带者的情况下，分析观察到的较高的非整倍体率的两个方面似乎是至关重要的。

第一个方案，PGD-FISH方案作为一个最简单的PGD方案。尽管它有一些局限性，如细胞核固定缺陷，杂交模式异常等无法检测，但它仍是目前使用最频繁的筛选方法。然而，以上例子表明FISH并不是一种完全可靠的方法。这就是为什么对结果的解释常常令人怀疑，并需要重新检测的原因。同时，对非整倍体囊胚的过高估计也可能导致妊娠结果的失败。

为了进行全基因组扫描，研究人员开发了比较基因组杂交方法。然而，技术的进步将引向分子遗传学测序的黄金标准。而NGS是一种快速发展的数据处理技术，具有数据量大、应用范围广的特点。不同的NGS平台的开发和成本的降低使它们能够引入植入前诊断（PGD）。在筛选异常分离易位的病例中，利用该方法对每条染色体的多个扩增进行计数，并与健康个体获得的片段进行比较。基于NGS的PGD方案通过实现对人类基因组序列的高覆盖，可以精确分析所有人类染色体拷贝的数量。最后，我们确认了基于NGS的PGD对罗氏易位的积极作用。我们认为，在应用NGS技术后，获得健康婴儿出生只是第一步，下一步需要确认基于NGS的PGD方案在筛选胚胎倍性状态方面的可靠性。