单基因遗传病是指人类因单个基因缺陷所引起的遗传病，包括核苷酸变异、基因内片段插入、缺失、重复等。按其遗传方式可分为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传、X连锁显性遗传、X连锁隐性遗传、Y连锁遗传和线粒体遗传。估计超过1万种人类疾病为单基因遗传病。单基因遗传病具有先天性、终身性等特点，由于绝大部分单基因遗传病无法从根本上治愈，一旦罹患单基因遗传病，将对家庭和社会造成严重的负担。SGD-PGD技术可以在胚胎时期选择不携带致病基因的胚胎，能够从根本上切断单基因遗传病的遗传途径，从而达到避免后代罹患单基因遗传病的目的。在辅助生殖领域，单基因遗传病一直是研究热点，但是由于技术所限，现有的SGD-PGD方法都是针对某种特定的单基因遗传病设计胚胎检测方案，但由于胚胎细胞来源少、扩增困难、对操作者要求高，现有的SGD-PGD方案大多局限于几十种病种，对其余发病率较低的单基因遗传病则没有很好的检测方案。因此，建立一种通用的、操作简单的、适用广泛单基因遗传病的SGD-PGD方案就显得非常重要。

Karyomapping技术是美国Illumina公司生殖和遗传部门的首席科学家Alan Handyside教授发明的针对所有单基因遗传病的PGD技术，该技术采用Illumina的BeadArray专利技术，使用其专用分析方法，可以在一个平台上针对几乎所有的单基因遗传病进行检测。

Karyomapping技术原理及检测方法

Karyomapping技术是基于连锁分析技术检测胚胎单基因遗传病的方法，该方法可对单个或者数个细胞进行植入前单基因遗传病的检测，适用于父母有严重遗传病，或者父母生育过有遗传病患儿的家庭。

当前SGD-PGD主要通过检测疾病相关基因附近的短片段重复序列(short tandem repeats，STR)。每一种遗传性疾病的STR检测都必须针对每对要求测试的夫妻以及每一种遗传性疾病单独开发设计，需要由高度熟练的科学家进行操作。而这种单独设计STR检测方法的开发通常需要几周或几个月的时间，因此基于STR检测方法的复杂性意味着检测成本高、耗时，且仅少数特定的实验室可以开展。Karyomapping技术是采用连锁分析技术来检测单基因遗传病，通过对希望生育健康子代的父母和一位已知该单基因遗传病状态的近亲（如子代）作为参照，在全基因组范围内进行SNP位点的信息分析，确定与致病基因位点连锁的SNP单体型及与正常等位基因连锁的SNP单体型，再通过对活检胚胎细胞的SNP位点信息进行分析，判断胚胎所遗传的相应区段染色体的亲代来源。Karyomapping技术提供了一个全面的单基因遗传病的分析方法，而无须对特定的疾病和患者设计相应的检测方法。

Karyomapping技术的实验目标是确认每个胚胎是否遗传了和参照个体（如先证者）同样的致病染色体区段。该技术首先需要确认"可提供信息的(informative) SNP"。"可提供信息的SNP"是指可以根据该SNP的基因型，确认胚胎染色体是遗传于父源或是母源。在典型的分析实例中，发现20%～40%的SNP能够提供这样的信息，而其他SNP则是"不可提供信息的(non-informative)SNP"。在Karyomapping技术的分析中，有6万～12万个分布于整个基因组的SNP能够提供染色体定相(phasing)信息，这些SNP平均距离为15.5-31kb。表5-3-1列出了"可提供信息的SNP"和"不可提供信息的SNP"实例。

表5-3-1 "可提供信息的SNP" 和 "不可提供信息的SNP"

父亲	母亲	是否可提供信息
AB	AA	可提供父源信息
AB	BB	可提供父源信息
AA	AB	可提供母源信息
BB	AB	可提供母源信息
AA	AA	不可提供信息
AA	BB	不可提供信息
AB	AB	不可提供信息
BB	BB	不可提供信息
BB	AA	不可提供信息

注：标记下划线的位点为可提供信息的SNP等位基因

如表5-3-1所示，"可提供信息的SNP"需要满足父方和母方在同一位点的SNP需要一个是纯合、一个杂合；标记下划线的SNP等位基因可用来定相胚胎和参照个体是否在同一位置，该SNP称作"可提供信息的SNP"。如果胚胎和参照个体在同一位点遗传了或者没有遗传"可提供信息的SNP"，则两者从父母处遗传了同样的染色体，反之则遗传了不同的染色体。如果胚胎和参照个体遗传了同样的染色体，这种情况称之为"同相(in phase)"，反之则为"不同相( out of phase)"。表5-3-2是一个胚胎父源染色体定相的例子。

表5-3-2使用可提供信息的等位基因进行胚胎父源染色体定相

父亲	母亲	参照个体	胚胎	定相
AB	AA	AB	AB	同相
AB	BB	BB	AB	不同相
AB	BB	AB	BB	不同相
AB	BB	AB	AB	同相
AB	AA	AA	AA	同相
AB	AA	AB	AA	不同相
AB	BB	BB	BB	同相
AB	AA	AA	AB	不同相
AB	BB	BB	AB	不同相
AB	BB	AB	BB	不同相

注：标记下划线的位点为可提供信息的SNP等位基因

基因分型检测中ADO，如等位SNP中一有个SNP位点扩增失败而无法检测，会对结果造成很大的影响。ADO在WGA中随机出现，且每个等位位点的影响均等。在最严重的情况下，有将近80%的位点会发生ADO。使用Karyomapping技术检测时，因为有大量的SNP数据用于定相分析，所以该技术即便有相当高比率的ADO仍能够对结果进行判读。实际分析中，ADO可能造成胚胎中"可提供信息的SNP"丢失，一个基因型为AB的位点，有可能判读为AA，或者BB。因此我们将"提供信息的SNP"分类为"关键(key)SNP"和"非关键(non-key)SNP"。"关键SNP"是指该SNP为"可提供信息的SNP"，且ADO对其定相不会有影响，"关键SNP"是定相最为主要的工具；"非关键SNP"不是真正的纯合，往往因为ADO而丢失了"可提供信息的"位点，从而改变了这些位点的定相，"非关键SNP"不能用于定相（见表5-3-3）。

表5-3-3 "关键SNP" 和 "非关键SNP"

提供信息方式	父亲	母亲	胚胎检测结果
可提供父源信息的SNP	AB	AA	AB(关键SNP）
			BB(关键SNP）
			AA（非关键SNP）
	AB	BB	AB(关键SNP）
			AA(关键SNP）
			BB（非关键SNP）
可提供母源信息的SNP	AA	AB	AB(关键SNP）
			BB(关键SNP）
			AA（非关键SNP）
	BB	AB	AB(关键SNP）
			AA(关键SNP）
			BB（非关键SNP）

注：标记下划线的位点为可提供信息的SNP等位基因

Karyomapping技术采用Illumina的SNP芯片获取待检样本每个SNP位点的信息，并将这些信息导人BlueFuse Multi软件，对每一个位点的SNP的信息进行分析，从而获得胚胎每条染色体单倍型区段( haploblocks)信息，并显示在软件界面上。根据单倍型区段信息，结合每个区段“关键SNP”和“非关键SNP”的信息，对胚胎每条染色体的致病基因携带状态进行评判。根据足够的SNP统计和可视化的结果，实验人员可作出相应判断。

Karyomapping技术有以下优点：

与现有的STR技术相比，流程更快，可快速获得结果； 准备较少，无须针对病例进行检测方案的个体设计； 覆盖广泛，几乎适用于所有单基因遗传病。

2.Karyomapping技术主要流程

KaIyomapping技术使用Illumina的SNP芯片确定一个特定等位基因的基因型。该技术主要分为3个过程，①使用SureMDA DNA扩增系统对待检卵裂球细胞或滋养外胚层细胞基因组DNA进行WGA，以满足后续操作流程的需求量。SureMDA DNA扩增系统专用的缓冲液和试剂可从单个或几个细胞中获得大量的DNA。②将扩增得到的胚胎DNA，以及父母和参照个体（如先证者）基因组DNA同时与Human Karyomap-12 Bead Chip杂交。③在iScan或者NextSeq 550扫描系统中进行芯片扫描后，使用含Karyomapping技术模块的BlueFuse Mult分析软件对结果进行分析、呈现。

3.Karyomapping技术应用案例

Karyomapping技术在SGD-PGD方面有着广泛的应用，使用Karyomapping技术的SGD-PGD不需要针对特定的疾病或患者进行专门的方法设计，仅需从父母和近亲获得已知疾病状态的血液样本，确定特定致病基因位点后，通过比较胚胎染色体中致病基因位点所在的DNA片段与已知疾病状态亲属的同一片段的一致性来判断胚胎是否也携带此致病突变，显著减少PGD所需的时间。由于Karyomapping大约有300000个覆盖全基因组的SNP，这意味着采用该技术可以筛查几乎任何一种单基因遗传病。

Karyomapping技术目前已经对超过26种单基因遗传病进行检测,并与传统的STR-PCR的方法进行了对比验证。Natesan等对44个单基因遗传病家系的218胚胎样本使用Karyomapping技术重新进行了双盲分析。将采用Karyomapping技术分析的结果与之前采用直接突变检测和靶向单倍型分析的结果进行比较，发现97.7%( 208/213)的胚胎样本与之前的分析结果完全一致。在37个单基因遗传病家系中，共156个胚胎两者的分析结果完全一致；一个Peutz-Jeghers综合征的PGD病例由于在STR位点间出现了染色体重组（通过Karyomapping分析发现），且无法在基因附近找到提供信息的STR标记，而最近的STR位点只能提供部分有用信息，因此该病例的PGD主要是根据突变检测结果进行判断，无法排除ADO的影响；如果将亲代的染色体重组情况加以考虑，则传统方法STR等位基因的定相分析和Karyomapping的结果完全一致。在剩余的7个病例中，由于样本存在大片段的同源片段，STR标记仅能提供部分信息，这些病例也是主要根据突变位点信息进行判断，Karyomapping技术和传统方法有91.2%( 52/57)的一致***.8%( 5/57)的卵裂球活检样本存在结果不一致的情况；进一步分析结果显示，传统检测方法仅用1个STR标记来判定结果，而Karyomapping的结果有更多的SNP来支持，因此这些不一致的结果需要更多的研究来验证。

总之，与现有PGD检测方法对比，Karyomapping不仅能准确地获得检测结果，而且灵活性较好。此外,Karyomapping的另一个优势是在进行SNP基因型分析的同时，可同时检测染色体变异以及其亲代来源，包括非整倍体及染色体的部分缺失。