概述

 

胚胎植入前基因检测技术（PGT）是一项新兴技术，用于识别怀孕前通过体外受精(IVF)产生的胚胎中的基因缺陷。胚胎植入前遗传学诊断(PGD)是指当一个或两个遗传父母中有一个已知的遗传异常，并对胚胎进行检测，以确定它是否也携带遗传异常。相比之下，植入前基因筛查(PGS)是指从染色体正常的遗传亲本中筛选遗传胚胎的技术。

由于只有未受影响的胚胎被转移到子宫内进行植入，植入前基因检测为目前的受孕后诊断程序(如羊膜穿刺术取样)提供了另一种选择可能。如果受孕后才发现结果不理想，往往很难决定终止妊娠。目前，PGD和PGS是唯一的选择，可避免植入前儿童患遗传疾病的高风险。它是预防遗传性疾病的一种有吸引力的手段，从而消除了产前诊断不利后终止妊娠的困境。

历史

1968年，爱德华兹和加德纳成功地对兔子胚胎进行了第一次的胚胎活检。PGD是上世纪80年代中期在英国发展起来的，作为目前产前诊断的一种替代方法。最初，PGD只是预防X连锁疾病的间接手段，间接也能预判男女（判断性别）。1989年，在伦敦，汉迪赛德和报告了第一个在PGD后出生的未受遗传病影响的儿童，该儿童不再有X染色体相关疾病。

截至2006年，已报告超过15,000个PGD实验。目前，PGD可用于大多数已知的基因突变。虽然PGD的适应症已经确定，但PGS仍是一种相对较新的、不断发展的技术，仍然存在相当多的争议。

PGD的适应症

植入前基因诊断(PGD)是检查夫妇双方有已知的遗传病风险而做的检查。只有健康和正常的胚胎被转移到母亲的子宫，从而降低遗传基因异常和晚期妊娠终止(产前诊断阳性后)的风险。

这些包括:

• 有X染色体相关疾病家族史的夫妇
• 染色体易位的夫妇，可导致胚胎植入失败，复发性流产，或后代有明显的精神或身体问题
• 常染色体隐性疾病的携带者(对于常染色体隐性疾病的携带者，胚胎可能受到影响的风险为25%)。
• 常染色体显性遗传病携带者(常染色体显性遗传病携带者胚胎受影响的风险为50%)。

适用PGD诊断的范围

PGD应用于三大类疾病:(1)性别相关疾病，(2)单基因缺陷，(3)染色体疾病。

(1)与性别有关的疾病

与X相关的隐性疾病是通过携带者母亲传染给孩子的。它们通过一个异常的X染色体传递，并在儿子身上表现出来，而儿子没有从父亲那里继承正常的X染色体。由于X染色体通过母亲传给后代/胚胎，所以导致患有该类遗传病的父亲如果有儿子，那么儿子不会遗传这种病。但如果母亲是携带者，他们的女儿有50%的风险也成为携带者。与性别相关的隐性疾病包括血友病、脆性X综合征、大多数神经肌营养不良症(目前已知的神经肌营养不良症数量>900)和数百种其他疾病。与性别相关的主要疾病包括Rett综合征、色素失禁症、假甲状旁腺功能亢进和维生素D抵抗性佝偻病

(2)单基因缺陷

PGD用于识别单基因缺陷，如囊性纤维化、泰-萨克斯病、镰状细胞性贫血和亨廷顿病。在这类疾病中，利用从单个细胞中扩增DNA的聚合酶链反应(PCR)分子技术可以检测到基因异常。虽然已经取得了不错的进展，但仍有一些单基因缺陷，如囊性纤维化，存在其他基因突变的可能。在囊性纤维化中，目前常规检测的突变只有25种。由于这些罕见的突变大多没有方法通过常规检测筛选出来，因此没有任何临床表现的囊性纤维化疾病的父母仍然可能是携带者。这使得携带罕见突变基因的父母有可能被检测为阴性，但仍有能力将突变的囊性纤维化基因遗传给后代。

PGD还可用于识别像BRCA-1这样的基因突变，BRCA-1不会导致特定的疾病，但会增加一系列妇科疾病的风险。

(3)染色体疾病

最后一组包括染色体疾病，其中可以使用荧光原位杂交(FISH)检测多种染色体重排，包括易位、倒置和缺失。FISH使用特定位点的端粒探针。有些父母可能从未在不使用PGD的情况下实现过妊娠，因为以前的受孕导致染色体不平衡的胚胎和自然流产。

PGS的适应症

大多数早期妊娠损失可归因于非整倍体。由于只有染色体正常的胚胎被转移到子宫中，目前还没有着床前基因筛查(PGS)的具体适应症清单。

一般需要做PGS的人群包括以下人士:

• 高龄产妇
• 有复发性流产史的产妇
• 多次试管受精失败的夫妇
• 严重男性不育问题的伴侣

由于非整倍体胚胎的比例很高，这些患者群体有试管婴儿失败的风险。PGS被认为可以通过选择染色体正常、植入几率较高的胚胎来降低这种风险。

(1)高龄产妇

儿童非整倍体的风险随着女性年龄的增长而增加。卵子中的染色体不太可能正常分裂，导致胚胎中出现额外的或缺失的染色体。在35-39岁的母亲中，胚胎中的非整倍体比率大于20%，而在40岁或40岁以上的母亲中，非整倍体比率接近40%。在35-39岁的母亲中，儿童的非整倍体发生率为0.6-1.4%，在40岁以上的母亲中为1.6-10%。由于一个具有非整倍体的胚胎不太可能足月，因此很可能流产，有些甚至在证实怀孕之前就流产了。因此，利用PGD检测胚胎的染色体组成，可以增加健康妊娠的机会，减少妊娠损失。

其中最常见的非整倍体之一是21号染色体的三体(即胚胎中存在3条相同的21号染色体)，通常我们也叫它唐氏综合症。这种特殊的异常也经常导致自发性流产，其真实发病率很难确定。

早期对高龄产妇进行PGS检查是很有帮助的，与对照组相比，PGS组流产率降低，活产率更高。尽管数据显示老年患者非整倍体发生率增加，但几项随机对照试验显示，常规PGS/PGD在高龄患者体外受精后并未增加妊娠率。尽管PGS在统计上似乎并没有提高高龄产妇的怀孕机会，但降低流产的风险，从而增加活产的几率。因此，应该选择性地使用PGS，因为它只对部分患者有疗效。

(2)复发性流产

复发性流产(RPL)通常定义为妊娠20周前连续2次或2次以上的流产。原因往往是未知的，但可能是胎儿畸形或子宫结构异常引起。染色体异常通常在50-80%的流产中的死胎里被发现，而且有RPL的夫妇的非整倍体胚胎的比例高于没有RPL的患者。然而，PGS的使用并没有提高患者的妊娠率，而是增加了活产的几率。

(3)多次试管受精（IVF）失败

多次IVF失败通常定义为3次或3次以上的胚胎IVF失败。有证据表明，这个患者群体有更大的可能性是染色体异常胚胎。然而，没有证据显示有多次IVF失败病史的患者通过PGS可以使妊娠率有改善。虽然大多数IVF失败可归结于胚胎非整倍体，但多种免疫因素和子宫内环境因素也会可能导致植入失败。

(4)男性因素不育

男性性腺功能衰竭与异常胚胎的产生有关，包括遗传和新生儿染色体异常的发生率增加。正常生育的男性大约有3-8%的精子染色体异常。严重不孕症(即精子数低、形态差、运动能力差)患者有约为27-74%的精子染色体异常。随着在试管婴儿技术中引入胞浆内精子注射(ICSI)，临床医生给精子质量差的男性提供了克服男性因素选择并成功产生受精卵的机会。

各种遗传缺陷已被发现与男性因素不孕有关。这包括非整倍体、最常见的克氏综合征、罗伯逊易位、Y染色体微缺失、雄激素受体突变和其他常染色体基因突变。因此，将Y基因突变传递给患者后代的高风险与ICSI有关。

在有严重男性因素不孕的夫妇中使用PGS/PGD可能会降低怀孕率，但也会限制染色体异常的患病率。因此不能推荐对这类患者的所有胚胎进行常规基因筛查。然而，如果夫妇确实选择继续进行PGS/PGD，他们可以得到遗传学家的建议，因为可以移植的正常胚胎数量可能会减少，导致受孕的机会会减少。

性别平衡

由于PGS可以决定胚胎的性别，许多夫妇要求PGS进行性别选择，这可能是由文化、社会、种族、心理等原因引起的，比如对家庭平衡的渴望。

使用PGS进行与疾病无关的性别选择是有争议的，而且当发现正常胚胎是不需要的性别时，没有植入这些胚胎引发了道德人士们的愤怒。常见的反对意见包括性别歧视、对女性的压迫、扩大对后代性别的控制等伦理因素。不同人群的个人、宗教、伦理和道德规范各不相同，在讨论性别选择的表现时，必须尊重这些观点。为了在性别选择方面达成合理的共识和接受PGS，仍然需要进行大量的论证。

白细胞抗原(HLA)匹配

PGD的新适应症之一是植入前HLA匹配。这项技术可用于排除遗传疾病的存在，但也可为患有隐性疾病(包括地中海贫血或白血病等）的儿童提供干细胞或骨髓移植的潜在可能。这种方法以前曾被用于避免凡科尼贫血患儿的出生，凡科尼贫血是一种常染色体隐性遗传病，其hla匹配的脐带血干细胞被成功移植（来源于其他兄弟姐妹），用于治愈该患病。

体外受精（IVF）

体外受精包括卵巢刺激、卵子取出、卵子受精、胚胎发育和胚胎移植(见下图)。

这些步骤可以概括如下:

• 为了产生多个卵子，需要刺激卵巢。在8-14天的激素刺激期间，经常进行超声检查和实验室测试，以监测卵泡的发育和成熟(含卵子的卵巢囊肿)。
• 卵母细胞提取过程通常在**下进行。在超声引导和经阴道入路下，穿刺滤泡并抽吸滤泡液。然后胚胎学家在胚胎学实验室鉴定卵母细胞。这个过程通常持续不到15分钟。
• 取出卵子后，将其培养数小时，以便最终成熟。如果需要，可以为PGD/PGS移除极体。对于胚胎发育后期的PGD/PGS程序，首选胞浆内精子注射(ICSI)，即将单个精子注射到单个卵子中。通过这种方式，ICSI可以防止多精子的机会和意外获得精子中的“额外”染色体物质，从而影响PGD/PGS的结果(即产生假阳性结果)。
• 用于卵子受精的精子通常在取卵当天通过手淫从男性伴侣那里获得。
• ICSI后，卵子如果有可以受精的迹象，那么马上进行受精形成胚胎（受精卵）。胚胎继续分裂成多细胞实体。一般当胚胎正常处于6-10细胞期时，可准备进行分裂期活检。

活检技术

大多数诊所进行分裂阶段的胚胎活检技术可能以下三种中的一种:

(1)极体活组织检查

极体活检只适用于女性染色体疾病。成熟中期的卵子中可以产生一个极体。这个极体可以被检测到，并提GL子染色体方面的信息。

因为只有通过分析极体才能获得关于母亲的信息，所以受精后发生的染色体异常(精子与卵子相遇时)是无法检测到的。

由于这种限制，导致这种技术目前很少使用。

(2)分裂时期胚胎活检

PGD/PGS最常见的方法是对第3天胚胎中的单个囊胚进行活检;这使得从发育中的胚胎中提取单个囊胚成为可能。囊胚的移除是一个技术上具有挑战性的过程。胚胎学家的目标是用一种特殊的显微镜和微操作器来移除一个完整的细胞，对剩余的胚胎造成最小的损伤(见下图)。

• 在从6-10细胞胚胎中提取单细胞之前，胚胎在培养皿中培养约20分钟，以减少囊胚与囊胚之间的粘附。
• 然后用吸液管将胚胎固定在一边;同时，在透明带内开一个小口，以便容易地进入囊胚。这个打开的过程叫做辅助孵化。辅助孵化可以用稀酸性溶液，或用锋利的刮刀分离。在小开口形成后，通过开口放置移液管并聚焦于所选的囊胚，其中包含可见的细胞核。随后，囊胚被轻轻吸入移液管并被排出到培养皿中。

然后，根据要研究的遗传条件，对囊胚进行处理，进行FISH或PCR分析。

卵裂期活检的局限性在于获得的囊胚可能不能完全代表整个胚胎。

(3)胚胎活组织检查

囊胚的形成开始于卵子取出后的第5天，由内细胞团和外细胞团或滋养外胚层的存在来定义。在发育的这个阶段，胚胎由100多个细胞组成。透明带中有一个孔，其分裂阶段胚胎活检所描述的方式相似，并使用细活组织移液管从滋养外胚层中取出细胞。内部细胞团块不受干扰。遗传分析是通过FISH或PCR分析。

缺点是从营养外胚层获得的细胞，由于嵌合体(具有多种不同类型的细胞系)而不能代表发育中的胚胎(内部细胞团)。此外，遗传/非整倍体检测大约在胚胎活检的24-48小时内完成;由于实验室胚胎存活能力有限(取卵后≤6天)，很多胚胎直到胚胎移植时才存活。因此，活检的囊胚必须冷冻。

基因检测

在大多数情况下，基因/非整倍体检测可以在胚胎活检后24小时内完成，允许第4天或第5天胚胎移植。由于胚胎在实验室的存活能力有限，只有不到一半的染色体可以被及时评估。然而，许多实验室正在开发快速的方法来评估所有24条染色体(22个常染色体加上2个性染色体)。

聚合酶链反应（PCR）

PCR用于诊断单基因缺陷，包括显性和隐性疾病。PCR，有时也称为DNA扩增，是一种扩增技术，其中一个特定的DNA序列被复制多次，以方便分析。PCR能将单个DNA分子快速扩增成数十亿个分子。

被检测DNA片段被浸泡在含有DNA聚合酶、未附着核苷酸碱基和引物的溶液中。溶液加热，以打破DNA链之间的链接。当溶液冷却时，引物与分离的链结合，DNA聚合酶通过将游离核苷酸碱基连接到引物上，快速构建新的链接。通过重复这一过程，一个由一个引物形成的链与另一个引物结合，产生一个新的链，它只针对所需要的片段。这个过程的进一步重复可以在数小时内制造出数十亿份的DNA片段。

PCR是一种相对快速、简便的检测DNA的方法。该方法已应用于多种植入前基因检测方案中。然而，它需要足够数量的高质量DNA样本，有时很难从单细胞(如极体或囊胚)中获得。

由于只有一个细胞应该被放大;然而，如果另一个细胞或DNA片段进入试管，它也会被放大。ICSI必须被用来最小化这个问题，并确保没有多余的精子存在(父系污染)，并且所有的卵母细胞都被移除(母系污染)。

必须严格控制实验室环境，避免污染物进入被检测的材料中。实验室技术人员必须训练有素，才可以避免各种外来干扰。

PCR错误可导致误诊，导致异常的胚胎被植入或丢弃正常胚胎。其中一个错误是由等位基因缺失现象引起的。这是指在PCR过程中，一个等位基因优先于另一个等位基因的扩增，主要是显性疾病的PGD或隐性疾病携带两种不同的突变，而只分析一种突变时的问题。在常染色体显性遗传病中，隐性遗传病移植受累胚胎的风险分别为11%和2%。

荧光原位杂交（FISH）

FISH用于X连锁疾病、染色体异常和非整倍体筛选的性别测定。FISH作为一种非整倍体筛检工具，在PGS筛检中更常用。探针(即与被分析染色体相匹配的一小段DNA)与特定的染色体相结合。每个探针都用不同的荧光染料标记。这些荧光探针应用于细胞活检样本，并有望附着在特定的染色体上。他们可以在荧光显微镜下观察。计算细胞中每种类型(颜色)染色体的数目。因此，遗传学家可以区分正常细胞和异常细胞，如非整倍体细胞(见下图)。

可以用FISH探针分析的染色体包括X、Y、1、13、16、18和21。

按PCR/FISH分类的PGD应用

按照PCR的分类如下:

• 常染色体疾病的单基因缺陷
• 男性不育的单基因缺陷
• X-连锁疾病的性别鉴

PCR可分为以下几类:

• 高龄产妇非整倍体筛查
• 男性不育的非整倍体筛查
• X染色体相关疾病的性别鉴定
• 由父母易位引起的反复流产

人类细胞包含23对染色体;然而，FISH分析只能精确评估每个活组织细胞中的7-9条染色体。因此，如果是异常的胚胎，仍然可能未被发现，并可能被植入母体。

目前，这项技术需要72小时，而且由于胚胎在培养中存活的时间有限，胚胎冷冻保存是必要的，以提供获得诊断所需的时间。即使细胞存活率很高，冷冻保存也会导致30%的存活胚胎丢失。

PGD的展望和挑战

有生育能力的患者必须接受试管受精（IVF）以产生合适的胚胎，并接受与试管受精治疗相关的风险咨询(即，对于那些因单基因疾病而接受PGD的患者，或者对于那些因复发性妊娠丢失而接受PGD的患者)。

患者必须接受必要的遗传咨询，避免选择错误的体外受精方式，以免遗传疾病对受儿童和家庭的影响。

鉴于目前PGD/PGS技术的固有局限性，以及胚胎嵌合可能导致误诊，建议患者有必要进行产前诊断(绒毛膜绒毛取样或羊膜穿刺术)，即使进行PGD/PGS时毫无问题也一样要做。

还必须讨论其他治疗方案，例如GL供精。

即使成功的体外受精和PGD手术，也不能保证移植后一定怀孕，也不能保证最终100%分娩成功。

大量的卵子或胚胎可能被发现是异常的，因此只有少数或没有健康隐患的胚胎可以移植。

对于非整倍体筛查，并不是所有的染色体或基因异常都可以诊断，因为只有有限数量的染色体可以同时检查。

目前，只有一个特定的检查单一的活检细胞是可用的。单个细胞不能被筛选到多种遗传条件。

一些单基因疾病可能不适合PGD。

PGS的展望和挑战

PGS仍然是一个有争议的技术。尽管最初被认为是一种识别和避免高危妇女胚胎非整倍体的方法，但最近的研究表明，可能仅限于特定的患者群体。

FISH技术上的限制

目前，FISH对23条染色体中的不到一半进行了评估;通常9-11被分析。许多实验室正在提高分析所有染色体(22个常染色体和2个性染色体)的效率。利用比较遗传杂交(CGH)和FISH进行的研究表明，多达25%的非整倍体胚胎被认为是正常的，因为没有对异常染色体进行分析。此外，约10%的细胞被移除用于筛选。

单细胞活检的局限性

如果在减数分裂过程中不发生分裂，那么胚胎中的所有细胞都是非整倍体。然而，如果在有丝分裂过程中受精后发生不分离，那么胚胎中可能存在两个或多个细胞系。因此，目前的单细胞活检技术可能会对正常和异常细胞的镶嵌胚胎进行误诊。

高龄产妇

高龄产妇使用PGS的结果好坏参半。对于复发性流产和平衡易位的高龄夫妇产妇可能受益于PGS。

其他问题

到目前为止，还没有关于PGD/PGS胎儿畸形率增加的报告。

由于可用于胚胎移植的染色体正常胚胎数量减少，使用PGD/PGS的IVF可能比不使用PGD/PGS的IVF导致更低的妊娠率。这在高龄产妇中尤其如此，因为她们通常产生很少的胚胎，而且往往质量很差，更容易受到胚胎活检的损害。

优势

目前的技术可以帮助消除一些基因疾病(如囊性纤维化，亨廷顿病，X-连锁营养不良)。因此，提前预防这种疾病比妊娠时等待产前检查结果要好。

产前基因疾病检测目前是通过羊膜穿刺术或绒毛膜绒毛检测(CVS)。如果检查结果显示胎儿有基因缺陷，父母可以选择生一个患有基因疾病的孩子，或者终止妊娠（人流）。这是一个非常困难的决定，因为这对母体是有创伤性的，特别是在怀孕后期时。然而，PGD是在怀孕前进行的，因此消除了这个隐患。

在过去，患有遗传疾病的人知道自己是携带者，往往会选择不生孩子，以避免将疾病传给后代。现在，PGD让这些夫妇有机会生一个没有携带遗传病的孩子。

未来

1988年首次成功进行了人类植入前基因诊断(PGD)。然而，从那时起，PGD的发展和被人们接受就比较缓慢，这主要是由于学习单细胞诊断技术所需要的时间以及成本。PGD是一种相对较新的方法，目前正在进行许多研究来扩大和改进PGD。然而，在PGD成为一个更全面、更可接受和更广泛使用的技术之前，还必须完成更多的工作。考虑到与PGD/PGS相关的技术性，应该仅限于具有微操作经验丰富的生殖中心。

几乎每周都有专业文献发表关于鉴定各种疾病相关的基因报告。在未来，可能会发现与常见疾病(如糖尿病、高血压、心血管疾病、子宫内膜异位症、癌症)有关的遗传基因，而PGD将可用来控制这些疾病向后代的传播。

虽然PGS已被纳入到接受IVF治疗的患者管理中，但它的适应症、效用和结果仍然是生殖医学研究的一个活跃领域。随着胚胎水平植入前筛查的优化，其在医学和社会中的地位将继续引发争议和伦理讨论。